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常用的半抗原与蛋白偶联方法简介

更新时间:2016-06-17 15:47:12点击?#38382;?/small>1276次
  常用的半抗原与蛋白偶联方法简介
———文章转自zjubell, 发表在丁香园免疫学技术论坛。
(一)?#32959;?#20013;含有?#28982;?#25110;可?#28982;?#30340;半抗原的偶联)
1、混合酸酐法,也称氯甲酸异丁酯法(isobutyl chloroformate method)
偶联时,半抗原?#32959;?#20013;的?#28982;?#21487;与氯甲酸异丁酯在有机溶剂中形成混合酸酐(mixed acid anhydride),然后与蛋白?#32959;?#20013;的氨基形成肽键。
氨甲喋呤(MIT)与β-半乳糖苷酶偶联的混合酐法
1、5.8mg MIT用0.1ml二甲基甲酰胺溶解,冷却至10度,加2ul氯甲酸异丁酯,10度搅拌反应30分钟。
2、1.5mg酶用2ml 50 m mol/L Na2CO3溶解。
3、10度反应4小时(必要时加NaOH,以维持溶液的pH为9.0,q然后4度过夜。
4、过sephadex G-25层析柱,柱用含NaCl 100m mol/L、MgCl2 10 m mol/L、2-巯基乙醇10 m mol/L的50m mol/L Tris-醋酸缓冲液(pH7.5)平衡和洗脱,合并含酶的洗脱管内液体,进一步纯化后,保存于含BSA 0.1%(w/v)、NaN3 0.02%(w/v)的缓冲液中。
2、碳化二亚胺法制备3,3`,5-三碘甲腺氨酸-血蓝蛋白免疫原的操作步骤
1、  取EDC 100mg , 用pH8.0的10 m mol/L PBS液2.5ml使之充分溶解(I液)
2、  取3,3`,5-三碘甲腺原氨酸 25mg , 用0.2mol/L NaOH 溶液2ml 溶解(II液)
3、  取血蓝蛋白(lemocyanin) 25mg, 溶于10mmol/L PBS (pH8.0)液中(III液)
4、  将II液与III液混合,在磁力搅拌下逐滴加入I液(余下0.5ml)
5、  室温下避光搅拌1小时,逐滴加入余下的I液
6、  4度搅拌12小时
7、  静置10小时(4度)
8、  有蒸馏水使之充分透析(约48小时),得免疫原。
3、?#22411;?#19982;与β-半乳糖苷酶偶联的N-羟琥珀酰亚胺酯法
1、  用二垩烷(dioxane)溶解?#22411;?11-半琥珀酸酯,配成浓度为100m mol/L的溶液。
2、  加羟琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide) 100 m mol/L 和 DCC(二环已基碳化二亚胺),200 m mol/L, 4度反应16小时。
3、  用簿层扫描方法纯化(氯仿:水=9:1)
4、  按?#22411;?酶摩尔浓度比约为10的比例,将上述溶液加入到酶液(用pH7.4,浓度50 m mol/L的磷酸缓冲液溶解)中。
5、
(二)含有氨基或可还原硝基半抗原的偶联
1、芳香胺类半抗原与蛋白质重氮化偶联的操作步骤
1、  用0.1 mol/L HCl溶液配制 4 m mol/L浓度的半抗原。
2、  滴加1%NaNO2(过量),4度?#20013;?#25605;拌。NaNO2的加入量可用淀粉-碘化物试纸或在白色磁砖上加1%淀粉和50m mol/L KI进行监控。游离亚硝酸可将氧化物氧化成碘,碘再与淀粉反应变成蓝黑色。
3、  溶液变成蓝黑色后,继续反应15分钟。
4、  用pH9.0、浓度为200m mol/L的硼酸或碳酸缓冲液溶解蛋白。
5、  边搅拌,边加入重氮化的半抗原(防止局部发生酸过量现象),调节pH到9.5。
6、  冰箱中搅拌反应2小时,?#27426;系?#33410;pH到9.0。
7、  用PBS透析2天
8、  -20度保存(浓度为20mg/mL)
双功能的酰亚胺酯(imidate esters)可?#22253;?#22522;反应,形成脒。例如:用二甲基已二酰亚胺酯(dimethyladipimide)将去甲基三正喋呤(desmethylmortriptyline)与β-半乳糖苷酶偶联。
2、、应用双功能酰亚胺酯(imidate esters)制备去甲基三正喋呤-与β-半乳糖苷酶标记特的操作步骤
1、  用含5%(W/V)N-?#19968;?#21527;啉的无水甲醇0.4ml,在室温?#27695;?#35299;570ug去甲基三正喋呤和488ug 二甲基已二酰亚胺酯(dimethyladipimide)(A液)
2、  取与β-半乳糖苷酶 100 ug, 溶于pH9.9的100 m mol/L碳酸缓冲液(含MgCl2 10m mol/L,2-巯基乙醇 10 m mol/L 0.1ml(B液)
3、  将A液倒入B液。
4、  20度反应90分钟后,加含NaCl 100 m mol/L, MgCl2 10 m mol/L和2-巯基乙醇 10 m mol/L、pH7.5的Tris-醋酸缓冲液(50m mol/L) 1ml, 终止反应。
5、  过sephadex G-25, 去除小?#32959;?#29289;质,得酶标记物(约75%的酶与半抗原结合,但用三正喋呤代替去甲三正喋呤(demethylmortriptyline )进行偶联,则只有15%的酶与之结合。
(三)含巯基半抗原的偶联
可用马来酰亚胺方法与蛋白偶联。此外,将载体蛋白用溴乙酰胺(bromoacetamide)激活。或将载体蛋白与半抗原在pH4.0的醋酸缓冲液中,通过过氧化氢的作用形成二硫键,也可以将半抗原连接到蛋白质?#32959;?#19978;。
(四)含羟基的半抗原偶联
醇类羟基通过形成半琥珀酸酯转化为?#28982;?#30340;操作步骤
1、  15g 2,2,2-三氯乙醇(2,2,2-trichloroethanol),12g 琥珀酸酐(succinic anhydride)和8.7ml 三?#19968;?#33018;(triethylamime)用100 ml乙酰乙酯溶解。
2、  加?#28982;?#27969;1小时。
3、  减压蒸馏去溶剂,,残余物用5% NaHCO3水溶液溶解。
4、  用乙醚洗涤两次,然后用H2SO4进行s酸化(pH到2.0).
5、  用水洗涤固形物(为三氯?#19968;?#21322;琥珀酸酯)两次,用氯仿-已烷使其结晶(产量约75%,熔点88-89度)
6、  取2.5g 半琥珀酸酯溶于6.5ml 亚硫酰氯(thionyl chloride)中,65度加热30分钟。
7、  减压蒸发,干燥1小时(高度真空条件下)。
8、  将上述产生(2,2,2-三氯忆基琥珀酰氯)溶于15ml N,N-二甲基-乙酸乙酰胺(N,N-dimethylethylacetamide)中,室温搅拌反应2小时。
9、  65度真空蒸发后,用异丙醇使结晶析出来(得盐酸化的结晶---5`-酯约84%,熔点160度)。
10、用溶于二甲基甲酰胺中的锌和醋酸解离三氯乙酯,得f半抗原-半琥珀酸酯,这样引和的?#28982;?#21487;与蛋白质偶联(如用碳化二亚胺化)。
半抗原用NaIO4氧化其中的糖苷醇后再与蛋白质偶联的操作步骤
1、  20mg 腺苷溶于1ml 100m mol/L NaIO4溶液中,4度避光反应30分钟。
2、  加1?#25105;?#20108;醇(得A液)
3、  将A液加入到β-半乳糖苷酶液(20mg/ml,用150m mol/L NaCl,10m mol/L MgCl2水溶液溶解,用3%K2CO3调节pH至9.0)中
4、  4度反应2小时,期间?#27426;系?#33410;pH9.0
5、  加入临时配制的50 mg/ml NaBO4溶液,用量为反应体积的1/10。 4度反应过夜。
6、  用含有MgCl2 10m mol/L,2-巯基乙醇 10 m mol/L、 NaCl 100 m mol/L的50 m mol/L磷酸缓冲液(pH7.4)透析(更换透析液数次)
(五)含酮基或酮基半抗原的偶联
是将酮基经?#21069;?#31867;化合物处理变成肟类化合物,再进一步将肟类化合物中的羟基,衍变成?#28982;?#21270;合物,再进一步进行含?#28982;?#21322;抗原的偶联操作。这类?#21069;?#31867;化合物主要有:氨氧乙酸aminoxy acetic acid 或羧甲氧胺carboxymethoxyl amine 或者盐酸?#21069;?br /> 酮基的类固醇?#32959;?#20013;引入?#28982;?#30340;操作步骤
1、  在200ml 乙醇中,加入O-(羧甲基)?#21069;?(O-(carboxyl)hydroxylamine)和酮基半抗原,使其浓度分别为10m mol/L 和4m mol/L
2、  加?#28982;?#27969;90分钟
3、  旋转蒸发,减少容积,然后加水至40ml,用乙醚抽提
4、  用水洗涤乙醚抽提物,用Na2SO4干燥成白色粉末。
(六)、其他半抗原的偶联
虽含有游离基团,但因这些基团对于维其生物活性十分重要,因些不能直接用来与载体蛋白 偶联。
制备雌二醇-6-肟的操作步骤
a、  雌二醇二醋酸盐的制备
1、  1g雌二醇溶于14ml 吡啶及3.5ml 醋酐中
2、  加?#28982;?#27969;1小时,冷却后倾入冰水中。
3、  收集白色晶体,得产物约1.1g(熔点126到127度)
b、  雌二醇-6-酮-二醋酸盐的制备
4、雌二醇二醋酸盐1.1g,滴加冰醋酸3.8ml 溶解后加含0.93g CrO3的含水冰醋酸6.35ml (H2O:Hac=0.75:5.6)
5、室温搅拌1小时,静置24小时
6、用水稀释,用乙醚提取4次
7、用蒸馏水洗2次
8、减压蒸馏,得结晶油状渣物。
9、用90度烘干20分钟,得粗制品约500mg
10、用11ml 无水乙醇溶解粗制品,再加1.1ml 冰醋酸及1.5g吉纳你特T试剂(Girad T),回流1小时。
11、冷却后,用冰致冷的蒸馏水稀释,用2.5mol/LNaOH调节pH至6.0-6.2.
12、用乙醚抽提3次,弃去乙醚。
13、水层用浓盐酸酸化(盐酸终浓度为1mol/L).
14、室温静置2小时。
15、用乙醚抽提3次。
16、合并乙醚抽提液,用0.125mol/L碳酸钠溶?#21512;?次,用蒸馏水洗3次。
17、用无水硫酸钠脱水,蒸干。
18、加7ml 醋酐,回流20分钟。
19、冷却后倾入用冰致冷的蒸馏水中,然后过滤、干燥得产物约176mg (熔点为162-166度)
c、  二醇-6-酮的制备
20、用5.5ml 20%的氢氧化钾-甲醇溶液(W/V)溶解雌二醇-6-酮-二醋酸盐(176mg),在室温下于氮气中水解24小时。
21、加蒸馏水稀释,用乙醚抽提3次。
22、在乙醚提取液中无水硫酸钠进?#22411;?#27700;,蒸发干燥,得产物约60mg(熔点为278-282度)
d、  雌二醇-6-肟的制备
23、取雌二醇-6-酮 50mg ,盐酸羧甲基羧胺50mg,溶于20%含水甲醇(V/V)7ml 和1mol/L醋酸钠4ml中,回流1.5小时。
24、减压、蒸馏、浓缩后,加蒸馏水20ml
25、用2 mol/L NaOH调节pH至8.5。
26、用醋酸乙酯抽提4次
27、水层用1 mol/L盐酸酸化至pH2.5。
28、用醋酸乙酯抽提4次
29、合并抽提液,蒸干,得产物约100mg(结晶熔点约186-188度)
其他半抗原如:青霉素、生物素、地高辛、荧光素等半抗原交联。
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