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对类风湿因子具有高反应活性的热聚IgG的制备

更新时间:2016-06-17 15:47:52点击?#38382;?/small>1458次
摘要:目的:优化热聚IgG的制备条件,提高对RF的检测灵敏度。方法:利用高效?#21512;?#20957;胶色谱和酶联免疫吸附技术研究加热条件对热聚IgG分子量分?#25216;?#20854;对类风湿因子结合能力的影响。结果:将IgG溶液(10mg/ml)62℃热聚30min,其优势聚合度为11左右,此时它对类风湿因子的结合能力最强。结论:应用高效?#21512;?#20957;胶色?#23376;?span>ELISA技术,对热聚IgG体系进行分离测定和活性分析,缩短了测定时间,提高了结果的灵敏度和准确性。

热聚IgG是在?#27426;?#28201;度条件下由IgG自身聚合而成的多聚体,它具有同类风湿因子(RheumatoidfactorsRF)反应的特性,常用于血清中RF的检测。IgG的热聚条件直接影响产物的结构及其生物反应活性。本文旨在利用高效?#21512;?#20957;胶色谱和酶联免疫吸附技术研究热聚条件对产物分子量分?#25216;?#20854;对RF结合能力的影响,优化制备条件,提高对RF检测的灵敏度。

1、材料与方法

1.1 材料?#20204;?#34507;白注射液由中国医学科学院血液病研?#20811;?#36141;得;RF-ELISA试剂盒由南京军区总医院购得;阳性类风湿血清由天津市第三中心医院提供。

1.2 方法

1.2.1 IgG的提纯根据Flodint的方法,利用SephadexG-200柱?#24212;们?#34507;白中提纯IgG

1.2.2 热聚IgG的制备将IgG溶液(10mg/ml)置?#27426;?#28201;度的恒温水浴中保温?#27426;?#26102;间,冰水冷却。

1.2.3 聚合度的测定利用校正的TSKG-4000HPLC色谱柱测定聚合物的分子量,计算聚合度。

1.2.4 RF结合能力的测定取热聚IgG溶液(2mg/ml)0.2ml,加入0.3ml类风湿血清和0.2ml生理盐水,混匀,室温反应1h后转入4℃冰箱过夜。用ELISA试剂盒测定反应前后体系中3RF的浓度,计算RF被结合的量。

2、结果

2.1 热聚温度的确定在聚合时间确定为30min的条件下,IgG的热聚发生在6064℃这样一个较窄的温度区间内。随着热聚温度的提高,聚合反应的程度加大,产物聚合度增加,对RF的结合能力增强。当热聚温度为62℃时,优势聚合度达11左右,对RF的结合能力最强。

2.2 热聚时间的确定在聚合温?#28909;?#23450;为62℃的条件下,热聚30min的产物对RF的结合能力最强。继续延长加热时间,产物聚合度的增加,但对RF结合能力开始下降。当加热时间达120min时,优势聚合度达22,聚合体系变成凝胶状,ELISA法无法测定其反应活性。

综上,对类风湿因子具有高结合能力的热聚IgG的制备条件是,将IgG溶液(10mg/ml)62℃下加热30min。在该条件下,产物对IgMRFIgGRFIgARF的结合量分别达802615247U/mgIgG

3、讨论

3.1 热聚IgG实际上是由一系列不同聚合度的分子组成的混合物,其最高分子量可达107D。该体系分子量分布的测定可采用光散射、葡萄糖密度梯度离心、常压凝胶层析等方法。其中光散射法只能给出体系的平均分子量;密度梯度离心法仅能分段给出部分聚合物的平均分子量;常压凝胶层析虽可获得?#19979;?#24847;的结果,但样品用量大?#28082;?#26102;过长。鉴于上述方法的不足,本文采用装有TSK-G-4000柱的HPLC,不仅使分离测定的时间大大缩短,而且提高了分辨率。本文采用ELISA法评价了热聚IgGRF的结合能力,较经典的免疫沉淀、免疫抑制?#30333;?#24230;分析相比,提高了灵敏度,而且可以分别检测出它对IgMRFIgGRFIgARF的结合能力,结果更为准确和全面。

3.2 RF因子是存在于类风湿关节炎患者血浆中的一类以自身变性IgG为靶细胞的抗体,能够与IgG分子Fc段上的抗原决定簇反应。热聚过程中,IgG发生构象改变,活性位点的数目和可及性提高,与RF的结合能力增强,并在某一条件下达到最大值。继续强化热聚条件,产物的反应活性开始下降。这可能因为聚合度的进一步增大降低了反应位点的可及性,或是剧烈的变性条件造成了原有活性位点的破坏。

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